文章來(lái)源：老千和他的朋友們

原文作者：孫千

本文主要講述拉曼光譜基礎(chǔ)知識(shí)。

想象一下，如果我們能夠"聽(tīng)見(jiàn)"分子的"聲音"，那會(huì)是什么樣的？拉曼光譜技術(shù)正是這樣一種神奇的工具，它能夠探測(cè)分子內(nèi)部原子的振動(dòng)模式，就像聽(tīng)音樂(lè)一樣識(shí)別不同的分子"指紋"。

在過(guò)去十多年中，拉曼光譜已經(jīng)從物理和化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)工具發(fā)展成為分析科學(xué)中最重要的技術(shù)之一。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)分子具有高度的敏感性，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，而且與紅外光譜不同，水的存在不會(huì)干擾檢測(cè)過(guò)程，更重要的是可以在不破壞樣品的情況下提供詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息。

基于這些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，拉曼光譜的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展。在材料科學(xué)中，它能夠識(shí)別石墨烯的層數(shù)和質(zhì)量，監(jiān)測(cè)半導(dǎo)體制造中的應(yīng)力狀態(tài)；在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它可以識(shí)別疾病的分子特征、檢測(cè)個(gè)別細(xì)菌；在太空探索中，它甚至被用于火星探測(cè)任務(wù)尋找生命跡象。

拉曼散射的基本原理

要理解拉曼光譜，我們先從一個(gè)簡(jiǎn)單的比喻開(kāi)始。當(dāng)光照射到分子上時(shí)，就像用手敲擊一個(gè)音叉。大部分光會(huì)按原來(lái)的頻率反射回來(lái)，這種現(xiàn)象被稱為瑞利散射。然而，有一小部分光會(huì)帶著分子振動(dòng)的信息返回，頻率發(fā)生了微小的變化，這就是拉曼散射現(xiàn)象。

這個(gè)現(xiàn)象的物理機(jī)制在于光與分子的相互作用。當(dāng)激光照射分子時(shí)，電磁場(chǎng)使分子產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩(為什么有電磁場(chǎng)？見(jiàn)備注——?dú)v史上的發(fā)現(xiàn))，可以用公式μ=αE來(lái)描述，其中α是分子極化率。關(guān)鍵在于分子的極化率會(huì)隨著原子振動(dòng)而發(fā)生變化，我們可以將其展開(kāi)為：

當(dāng)頻率為ω0的激光與頻率為ωq的分子振動(dòng)相互作用時(shí)，產(chǎn)生三種不同的散射：瑞利散射(ω0)保持原始頻率；斯托克斯散射(ω0?ωq)頻率降低，相當(dāng)于分子從光中獲得振動(dòng)能量；反斯托克斯散射(ω0+ωq )頻率升高，相當(dāng)于振動(dòng)分子將能量傳給光子。

并不是所有分子振動(dòng)都能產(chǎn)生拉曼信號(hào)，必須滿足選擇定則：(?α/?q)q0≠0，即分子極化率必須隨該振動(dòng)發(fā)生變化。

圖1 |分子振動(dòng)時(shí)發(fā)生兩種關(guān)鍵變化：極化率變化（分子"軟硬度"變化，紅線）產(chǎn)生拉曼信號(hào)，偶極矩變化（電荷分布"偏心程度"變化，藍(lán)線）產(chǎn)生紅外信號(hào)。雙原子分子只能拉伸振動(dòng)，三原子分子可拉伸、彎曲等多種方式。科學(xué)家通過(guò)觀察紅線和藍(lán)線的"起伏變化"，就能預(yù)測(cè)哪種振動(dòng)在拉曼或紅外光譜中出現(xiàn)，形成分子獨(dú)特的"光譜身份證"。

以具體例子來(lái)說(shuō)明：氧分子中兩個(gè)原子相互靠近或遠(yuǎn)離時(shí)，電子云分布變化導(dǎo)致極化率改變，因此其伸縮振動(dòng)是拉曼活性的。對(duì)于二氧化碳分子，對(duì)稱伸縮振動(dòng)（兩鍵同時(shí)伸縮）主要改變極化率，是拉曼活性的；而反對(duì)稱伸縮振動(dòng)主要改變偶極矩，是紅外活性的。

這揭示了重要的互補(bǔ)性：對(duì)稱振動(dòng)通常拉曼活性強(qiáng)而紅外活性弱，反對(duì)稱振動(dòng)則相反。因此拉曼光譜和紅外光譜是互補(bǔ)技術(shù)，結(jié)合使用可以獲得分子振動(dòng)的完整信息。

歷史上的發(fā)現(xiàn)

19世紀(jì)60年代，英國(guó)物理學(xué)家麥克斯韋通過(guò)數(shù)學(xué)推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)電場(chǎng)和磁場(chǎng)以特定方式相互轉(zhuǎn)化時(shí)，它們會(huì)以波的形式在空間中傳播，傳播速度恰好等于光速，這意味著光本身就是電磁波。換句話說(shuō)，當(dāng)我們看到一束激光時(shí)，實(shí)際上是在觀察空間中相互垂直的電場(chǎng)E?和磁場(chǎng)B?在振蕩，它們都垂直于傳播方向并以光速向前傳播。

因此，當(dāng)激光照射分子時(shí)，實(shí)際上是電磁場(chǎng)的電場(chǎng)分量直接作用在分子上，引起電子云的微小位移，產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩μ=αE。所以激光本身就是電磁場(chǎng)，這就像問(wèn)"為什么水波有水"一樣——因?yàn)榧す饩褪请姶艌?chǎng)的傳播形式，這正是拉曼散射現(xiàn)象得以發(fā)生的物理基礎(chǔ)。

拉曼信號(hào)強(qiáng)度的物理本質(zhì)

拉曼散射的強(qiáng)度遵循一個(gè)重要的物理公式：

這個(gè)公式揭示了拉曼散射的深層物理機(jī)制。其中極化率變化項(xiàng)(?q/?α)2q0表明只有當(dāng)分子在振動(dòng)過(guò)程中極化率發(fā)生變化時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生拉曼散射，這正是拉曼活性的根本判據(jù)。

頻率依賴項(xiàng)(ω0?ωq)4展現(xiàn)了一個(gè)重要特性：使用更高頻率的激光可以顯著增強(qiáng)拉曼信號(hào)，因?yàn)樾盘?hào)強(qiáng)度與頻率的四次方成正比。激光強(qiáng)度項(xiàng)E20則直接表明拉曼強(qiáng)度與入射激光功率成正比關(guān)系。

備注：α是分子的極化率，描述分子在外電場(chǎng)中產(chǎn)生偶極矩的能力。q是分子振動(dòng)的正常坐標(biāo)（描述原子運(yùn)動(dòng)的集體模式）。

這個(gè)公式也為我們指出了增強(qiáng)拉曼信號(hào)的兩個(gè)主要途徑：提高激光功率和頻率，或者通過(guò)特殊方法改變分子的極化率特性。

然而，拉曼散射本質(zhì)上是一個(gè)極其微弱的光學(xué)過(guò)程。在所有入射光子中，大約只有10?6的光子會(huì)發(fā)生拉曼散射（相對(duì)于瑞利散射的發(fā)生概率），絕大部分光子都會(huì)發(fā)生彈性的瑞利散射。這種固有的弱信號(hào)特性使得在實(shí)際應(yīng)用中必須發(fā)展各種增強(qiáng)技術(shù)來(lái)提高檢測(cè)靈敏度，這也促進(jìn)了拉曼光譜技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新。

備注：拉曼與熒光信號(hào)強(qiáng)度存在巨大差距，熒光截面比普通拉曼大14個(gè)數(shù)量級(jí)，即使在共振拉曼條件下信號(hào)增強(qiáng)若干倍，熒光仍比共振拉曼強(qiáng)約8個(gè)數(shù)量級(jí)（108倍）。文獻(xiàn)中常見(jiàn)的"10-6"表述并不是和熒光散射截面比。這14個(gè)數(shù)量級(jí)的強(qiáng)度差異正是普通拉曼光譜信號(hào)微弱、極易被熒光"淹沒(méi)"的根本原因，也解釋了為何拉曼檢測(cè)需要特殊技術(shù)來(lái)抑制熒光干擾。

共振拉曼光譜是最重要的增強(qiáng)技術(shù)之一，其原理基于量子力學(xué)中的共振現(xiàn)象。當(dāng)激光頻率正好與分子的電子躍遷頻率匹配時(shí)，就像音叉的共振一樣，分子的響應(yīng)會(huì)被極大放大。從量子力學(xué)的角度來(lái)看，分子的極化率可以表示為。

在這個(gè)表達(dá)式中，當(dāng)激光頻率ω0接近電子躍遷頻率ωri時(shí)，分母趨近于零，導(dǎo)致極化率急劇增大，從而使拉曼信號(hào)獲得高達(dá)108倍的增強(qiáng)。

圖2 |分子有多個(gè)能量層級(jí)，光照射時(shí)發(fā)生能量跳躍：普通拉曼是分子快速"彈跳"能量微調(diào)，共振拉曼是光能量匹配某層級(jí)跳躍更強(qiáng)烈，熒光是分子跳到高層后慢慢返回發(fā)光。三種對(duì)應(yīng)光譜各有特征：吸收光譜（綠線）顯示分子吸收哪些光，發(fā)射光譜（紅線）顯示分子發(fā)出哪些光，拉曼光譜（淺綠）顯示光與分子振動(dòng)的能量交換，共同構(gòu)成分子的"光學(xué)指紋"。

共振拉曼技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)不僅在于信號(hào)的大幅增強(qiáng)，更在于其選擇性特征。由于只有與特定電子躍遷耦合的振動(dòng)模式才會(huì)被增強(qiáng)，這使得復(fù)雜分子的拉曼譜圖得以顯著簡(jiǎn)化。研究者可以通過(guò)選擇不同波長(zhǎng)的激光來(lái)選擇性地研究混合物中的特定分子，甚至可以研究分子激發(fā)態(tài)的結(jié)構(gòu)信息。

以鳥(niǎo)嘌呤-5'-磷酸核苷的研究為例，這種選擇性特征展現(xiàn)得淋漓盡致。當(dāng)使用532納米的非共振激光時(shí)，所有振動(dòng)模式都會(huì)出現(xiàn)在譜圖中，使得譜圖變得相當(dāng)復(fù)雜難以解析。而當(dāng)改用244納米激光時(shí)，只有與π-π*電子躍遷相關(guān)的振動(dòng)模式被選擇性增強(qiáng)，大大簡(jiǎn)化了譜圖的復(fù)雜性。如果進(jìn)一步使用218納米激光，則會(huì)增強(qiáng)另一組不同電子躍遷相關(guān)的振動(dòng)模式，為研究者提供了不同角度的分子信息。

圖3共振拉曼光譜的選擇性。（底部）鳥(niǎo)苷-5'-單磷酸的紫外/可見(jiàn)吸收光譜（結(jié)構(gòu)顯示在右側(cè)）。箭頭標(biāo)記了三種不同的激發(fā)波長(zhǎng)，用于記錄拉曼光譜（頂部顯示）：532nm非共振拉曼光譜（右側(cè)），244nm（中間）和218nm（左側(cè)）共振拉曼光譜，涉及兩個(gè)不同的電子躍遷。

除了共振拉曼光譜，科學(xué)家們還發(fā)展了多種其他增強(qiáng)技術(shù)。表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)利用金屬納米顆粒的局域表面等離子體共振效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)106到1014倍的驚人增強(qiáng)。

備注：106-1014倍增強(qiáng)，主要指的是散射截面的增強(qiáng)，而不是整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的效率。實(shí)際檢測(cè)效率增強(qiáng)受綜合因素影響，通常遠(yuǎn)低于上述極限，視分子分布、表面活性、光學(xué)系統(tǒng)而變化，最常見(jiàn)的范圍是1/100到1/1000。

表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的發(fā)展

1974年，英國(guó)南安普敦大學(xué)的Fleischmann等人在進(jìn)行吡啶分子的電化學(xué)拉曼光譜研究時(shí)，意外觀察到銀電極上吡啶分子的拉曼信號(hào)異常強(qiáng)烈，增強(qiáng)了約10?倍。這個(gè)發(fā)現(xiàn)最初被歸因于電極表面電化學(xué)粗化導(dǎo)致的有效表面積增加，但1977年Jeanmaire和Van Duyne以及Albrecht和Creighton幾乎同時(shí)獨(dú)立證明，即使考慮表面積因素，仍存在10?-10?倍的"真正"增強(qiáng)效應(yīng)。這一認(rèn)識(shí)開(kāi)啟了表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)的發(fā)展歷程，標(biāo)志著拉曼光譜學(xué)的重大突破。

圖4金屬納米粒子就像裝滿可移動(dòng)電子的小球，當(dāng)光照射時(shí)，電子像海浪一樣集體有規(guī)律地來(lái)回振蕩，這種被"困"在粒子表面的電子集體振蕩就叫局域表面等離激元。當(dāng)振蕩頻率與光頻率匹配時(shí)，就像推秋千找準(zhǔn)節(jié)拍，電子振蕩變得特別劇烈，粒子周圍電場(chǎng)極大增強(qiáng)，這是表面增強(qiáng)拉曼光譜等技術(shù)的物理基礎(chǔ)。。箭頭表示電場(chǎng)。

SERS技術(shù)的增強(qiáng)機(jī)制源于兩個(gè)協(xié)同作用的物理過(guò)程。首先是電磁增強(qiáng)機(jī)制，它可以提供高達(dá)1011倍的信號(hào)增強(qiáng)。當(dāng)金屬納米顆粒在激光照射下激發(fā)局域表面等離子體時(shí)，這些等離子體就像天線一樣，在顆粒表面產(chǎn)生強(qiáng)烈的局域電場(chǎng)。電場(chǎng)增強(qiáng)因子為，其中g(shù)= (εi?ε0)/(εi+2ε0)，當(dāng)滿足等離子體共振條件時(shí)達(dá)到最大值。

圖5分子接近納米粒子表面時(shí)拉曼散射電磁增強(qiáng)機(jī)制的示意圖。

與電磁增強(qiáng)機(jī)制并行的是化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制，雖然增強(qiáng)倍數(shù)相對(duì)較?。?02-103倍），但同樣重要。在這個(gè)過(guò)程中，分子與金屬表面形成化學(xué)鍵，產(chǎn)生新的電子躍遷態(tài)，類似于表面誘導(dǎo)的共振拉曼效應(yīng)。這兩種機(jī)制的結(jié)合使得SERS成為目前最強(qiáng)大的拉曼增強(qiáng)技術(shù)之一。

理想SERS基底的設(shè)計(jì)需要滿足嚴(yán)格的物理和化學(xué)要求。首先，基底材料必須是等離子體活性金屬，主要包括金、銀和銅。銀具有最佳的等離子體性質(zhì)，在可見(jiàn)光范圍內(nèi)損耗最小，但化學(xué)穩(wěn)定性較差；金的化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)異，生物兼容性好，但等離子體響應(yīng)相對(duì)較弱；銅成本低廉，但容易氧化。

基底設(shè)計(jì)的科學(xué)原理和制備技術(shù)發(fā)展

基底的幾何結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)至關(guān)重要。納米顆粒間的間隙、尖端曲率半徑、表面粗糙度都直接影響電場(chǎng)增強(qiáng)效果。當(dāng)納米顆粒間距小于10納米時(shí)，會(huì)形成極強(qiáng)的"熱點(diǎn)"；尖銳的納米結(jié)構(gòu)通過(guò)"避雷針效應(yīng)"進(jìn)一步集中電場(chǎng)；適度的表面粗糙度（特征尺寸10-100納米）能夠激發(fā)多種等離子體模式，擴(kuò)大增強(qiáng)的光譜范圍。

SERS基底的制備技術(shù)經(jīng)歷了從簡(jiǎn)單的電化學(xué)粗化到精密納米加工的發(fā)展過(guò)程。早期的電化學(xué)粗化方法簡(jiǎn)單易行，但重現(xiàn)性差，增強(qiáng)效果不穩(wěn)定。納米球光刻技術(shù)通過(guò)單分散聚苯乙烯小球的自組裝，形成六方密堆積的掩膜，經(jīng)過(guò)金屬沉積和小球去除，制備出規(guī)整的納米三角形陣列，顯著改善了重現(xiàn)性。

圖6 |兩種新型SERS基底的例子。a)酶促生長(zhǎng)的金屬顆粒；b)電子束光刻制造的基底。

電子束光刻技術(shù)能夠精確控制納米結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和排列，制備出性能可預(yù)測(cè)的SERS基底。雖然成本較高，但為基礎(chǔ)研究和高端應(yīng)用提供了理想的平臺(tái)。近年來(lái)發(fā)展的模板輔助方法利用陽(yáng)極氧化鋁、二氧化硅膠體等作為模板，在降低成本的同時(shí)保持了結(jié)構(gòu)的規(guī)整性。

生物兼容制備方法的發(fā)展拓寬了SERS在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。酶促金屬沉積利用葡萄糖氧化酶等生物催化劑，在溫和條件下還原金屬離子，制備出形貌可控的納米結(jié)構(gòu)。DNA模板方法利用DNA分子的自組裝特性，引導(dǎo)金屬納米顆粒的定向排列，實(shí)現(xiàn)了生物分子水平的精確控制。

生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的突破

SERS技術(shù)正推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)生革命性變革，實(shí)現(xiàn)了從群體分析向單分子精準(zhǔn)檢測(cè)的跨越。該技術(shù)已具備單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞檢測(cè)能力，空間分辨率達(dá)50×50 nm2，甚至可清晰識(shí)別單個(gè)病毒的蛋白質(zhì)外殼和RNA結(jié)構(gòu)，為新藥開(kāi)發(fā)和抗藥性機(jī)制研究提供了前所未有的單細(xì)胞分析視角。

在分子診斷領(lǐng)域，通過(guò)創(chuàng)新的染料標(biāo)記策略，DNA序列檢測(cè)靈敏度達(dá)到10??-10?12M，為基因診斷和個(gè)性化醫(yī)療奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

更令人振奮的是，這些前沿技術(shù)正加速向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，基于SERS的血糖傳感器已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確穩(wěn)定的在線監(jiān)測(cè)，同時(shí)通過(guò)與微流控技術(shù)的深度融合，創(chuàng)造出僅需180 nL樣品的實(shí)驗(yàn)室芯片平臺(tái)，為臨床檢驗(yàn)、藥物研究和珍貴樣品分析提供了理想解決方案。

尖端增強(qiáng)拉曼技術(shù)的發(fā)展

針尖增強(qiáng)拉曼散射(TERS)技術(shù)代表了拉曼光譜技術(shù)發(fā)展的最新前沿。這項(xiàng)技術(shù)將SERS與原子力顯微鏡巧妙結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)獲得高空間分辨率和化學(xué)敏感性的目標(biāo)。TERS技術(shù)的空間分辨率可達(dá)20 nm，能夠檢測(cè)單分子水平的信號(hào)，成功突破了傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限的限制。

這種技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要在原子力顯微鏡的探針尖端制備納米級(jí)的金屬結(jié)構(gòu)，形成高度局域化的電磁場(chǎng)增強(qiáng)區(qū)域。當(dāng)激光聚焦到這個(gè)微小區(qū)域時(shí)，只有探針尖端正下方幾十納米范圍內(nèi)的分子會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。這樣既保證了極高的空間分辨率，又提供了足夠的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行化學(xué)分析。

TERS技術(shù)的發(fā)展為納米科學(xué)研究開(kāi)辟了新的可能性。研究人員可以在納米尺度上研究材料的化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)，觀察單分子的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，甚至跟蹤生物大分子的構(gòu)象變化。這項(xiàng)技術(shù)在納米材料科學(xué)、表面化學(xué)和生物物理學(xué)等領(lǐng)域都展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

技術(shù)挑戰(zhàn)

盡管拉曼光譜技術(shù)發(fā)展迅速，但仍面臨重要挑戰(zhàn)。理論層面，經(jīng)典電動(dòng)力學(xué)理論存在明顯局限：無(wú)法解釋轉(zhuǎn)動(dòng)拉曼光譜的離散能級(jí)、難以完全描述共振拉曼和SERS的具體機(jī)理，且缺乏與分子軌道理論的直接聯(lián)系。

實(shí)驗(yàn)方面挑戰(zhàn)更為突出。共振拉曼技術(shù)受熒光干擾嚴(yán)重，因?yàn)闊晒饨孛姹壤⑸浯?4個(gè)數(shù)量級(jí)，強(qiáng)吸收還可能導(dǎo)致樣品熱分解和光化學(xué)反應(yīng)。SERS技術(shù)則面臨重現(xiàn)性差、定量分析困難以及增強(qiáng)機(jī)制難以分離等固有問(wèn)題。

幸運(yùn)的是，這些挑戰(zhàn)正逐步得到解決。新型激光器和探測(cè)器提供更優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，SERS基底制備技術(shù)日趨穩(wěn)定，人工智能開(kāi)始應(yīng)用于光譜數(shù)據(jù)解析，為技術(shù)發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。